Logo chemomed - www.chemomer.ro
 
 
ROLUL SINERGIC AL TARATELOR DE OREZ ARABINOXYLAN IN
 
 
1) MAMDOOH GHONEUM
2) SASTRY GOLLAPUDI

1) UNIVERSITATEA DE STIINTE SI MEDICINA CHARLES R. DREW, DEPARTAMENTUL DE OTOLARINGOLOGIE, LOS ANGELES, CA 90059
2) IRVINE, UNIVERSITATEA CALIFORNIA, DIVIZIA DE IMUNOLOGIE CLINICA PRIMARA, IRVINE, CA 92718, U.S.A.

Abstract. Recent am demonstrat ca, celule canceroase ale sanului (CCS) sunt supuse apoptozei urmate de fagocitoza S.cerevisiae. A fost demonstrat ca extractul de tarate de orez arabinoxylan (MGN-3/Biobran) intensifica acest efect. Avand in vedere rezultatele trecute cand am obtinut utilizarea celulelor in suspensie, prezetul studiu a fost facut pentru a examina celulele canceroase unistratificate ale sanului care sunt mai apropiate de modelul celulelor canceroase dezvoltate. Celulele unistratificate ale ambelor cancere de san (MCF-7) si a celulelor epiteliale non-tumorale ale sanului (MCF- 10 A) cresc pe lame de sticla si au fost cultivate cu S. cerevisiae distruse la caldura intr-o proportie de 1:10. Celulele MCF -7 care au suferit fagocitoza fermenteaza intr-o maniera dependenta de timp, de la 6,9% la 14,3% de la 1 ora la 4 ore, respectiv cu 2 pliuri crescute in prezenta MGN-3. Pe de alta parte, virtual nu a existat fagocitoza la fermentarea celulelor MCF-10A. Similar, fermentatia a indus apoptoza celulelor MCF-7 aparute intr-o maniera dependenta de timp, de la 11,5 dupa 1 ora la 21,7% dupa 4 ore, si au crescut in prezenta MGN-3. Aceste informatii pot avea implicatii in tratamentul cancerului de san.

Cuvinte cheie:
celulele unistratificate MCF-7 (intr-un singur plan), apoptoza, fagocitoz, S.cerevisiae, MGN-3.
Apoptoza implica o multitudine de procese biochimice extrem de regulate. Unele dintre aceste elemente din aceasta multitudine include activarea proteinelor cisteina, denumite caspases, eliberarea mitocondriilor in cazul factorilor decesului, si in final, fragmentarea ADN-ului. Multe medicamente anticancer functioneaza prin inducerea apoptozei.
A fost demonstrat ca leziunile specifice intercelulare induse de diversi agenti terapeutici implica sistemul Fas/FasL, mitocondria si ADN -ul prejudiciat. Respectand faptul ca celulele imune distrug celulele canceroase, studii mai recente au aratat ca limfocitele efector, cum ar fi celulele NK si T, folosesc doua cai de a distruge celulele tumorale aflate in vizor. Prima cale utilizeaza legatura FasL cu receptorul sau Fas inducand apoptoza. A doua cale utilizeaza perforina, proteina capabila sa formeze pori si proteinaza serinei granzyme B in inducerea dezintegrarii celulelor urmarite.
Pe de alta parte, celulele tumorale dezvolta multiple strategii de a scapa de apoptoza indusa fie de sistemul de aparare (imunitar) al pacientului fie de agentii chimioterapeutici. Aceste strategii includ neutralizarea Fas-FasL, down-regulation (reglarea in scadere) a receptorilor distrusi care au mediat apoptoza, alterarile caii mitocondriale a apoptozei si up-regulation (reglarea in urcare) a proteinelor anti-apoptozice (e.g FLIP, IAPs) si a proteinelor rezistente din multitudinea de medicamente.
Celulelel tumorale pot de asemenea sa inactiveze CTL prin inductia apoptozei si secretia factorilor imunosupresivi. In plus, celulele tumorale T si celulele originale B dezvaluie activitate fagocitara mpotriva limfocitelor in vitro si impotriva limfocitelor proprii (autogene) la pacientii cu cancer in vivo. Exista de aceea un interes in mod particular pentru a gasi agenti care sa induca apoptoza celulelor canceroase cu efecte adverse minime.
Recent am oferit prima proba ca S. cerevisiae non-patogene, drojdia brutarilor si berarilor, induc apoptozele celulelor cancerului de san, celulelor scuamoase ale carcinomului limbii si adenocarcinomului de colon. In aceste studii celulele canceroase au crescut in suspensie. Deoarece celulele canceroase ale sanului cresc intr-un singur plan (unistratificat)ne-am gandit sa examinam in mod particular:
Daca celulele canceroase ale sanului de asemenea isi iau fermentii cand cresc intr-un singur plan;
Daca extractul de tarate de orez (MGN-3/Biobran) poate asocia (sinergiza?) efectul apopteozic al fermentilor;
Daca fermentul care a indus apoptoza este selectiv pentru celulele canceroase.
De aceea, efectele fermentului impotriva celulelor epiteliale ale sanului MCF-10A au fost examinate. In acest studiu s-a descoperit ca celulele unistratificate MCF-7 sufera apoptozele urmand ingestia/adaugarea fermentilor si acest proces este intensificat in prezenta MGN-3 si poate sugera specificitatea celuleor canceroase.

Materiale si Metode.
Linia de celule. Au fost folosite celulele umane ale cancerului de san MCF-7 si celule epiteliale ale sanului MCF-10 achizitonate din Colectia Americana de Culturi si Tesuturi, Manassas, VA, USA. Celulele au fost mentinute in laboratorul nostru intr-un mediu complet constand in RPMI-1640, suplimentat cu ser de gamba fetala, 2mM glutamine si 100µg/ml de streptomicina si penicilina.

Prepararea S.cerevisiae. Au fost utilizati fermenti (drojdie) disponibili in comert pentru brutari si berari, S.cerevisiae. Fermentul a fost distrus la caldura prin incubarea la 90º C timp de 1 ora, spalat o data si refacuta suspensia in fosfat cu solutie tampon salina inaintea aplicarii. Cuantificarea a fost dusa la capat utilizand un hemocitometru, iar suspensia celulara a fost ajustata la 1*10 la puterea 7 celule/ml.
MGN-3. MGN-3 este un arabinoxylan extras din tarate de orez care este enzimatic tratat cu extract de ciuperci Shiitake. Contin polizaharide (ß1, 3-glucan si hemiceluloza activata). MGN-3 a fost preparat proaspat prin dizolvarea in apa distilata la o concentratie de 100 mg/ml. MGN-3 a fost livrat de Daiwa Pharmaceuticals Co. Ltd., Tokyo, Japonia.

Cresterea celulelor unistratificate MCF-7 si MCF-10A in 8 rezervoare de metal. Un model de incercare a sistemului a fost dezvoltat pentru examinarea apoptozei celulelor unistratificate MCF-7 si MCF-10A urmand cultura cu fermenti. Sistemul ingaduie fagocitoza fermentilor si apoptoza prin aderenta si non-aderenta celulelor MCF-7 si MCF-10A monitorizate. In acest scop celulelor MCF-7 si MCF-10A le-a fost permis sa creasca in 8 rezervoare de metal (26*33mm fiecare) (LUX Scientific Corp., Thousand Oaks, CA, USA). Un recipient de sticla acoperit a fost plasat la baza fiecarui rezervor. 1*10 la puterea 5 celule MCF-7/ml au fost picurate in fiecare rezervor si li s-a permis aderarea (atasarea).
Dupa 2 ore celulele au fost spalate o data cu 1 ml MC (mediu complet). Fermentii (1*10 la puterea 6 in 5µl), in prezenta sau absenta MGN-3 (100µg/ml), au fost adaugati in fiecare rezervor si incubati la 37º C si 5% dioxid de carbon. Din timp in timp in intervalul de 1-4 ore celulele non-aderente si aderente au fost examinate dupa cum urmeaza:

Celulele non-aderente: Mediul cotinand celule tumorale non-aderente (1ml) a fost transferat in eprubete de sticla. Din suspensia de celule, 200µl au fost folositi la fabricarea preparatelor de cytospin. (Shandon Southern Instruments, Sewickly, PA, USA). Preparatele au fost stabilizate in 100% methanol, in mediu uscat, colorate cu 4% Giemsa pentru 15 min (Sigma-Aldrich Corp., St.Louis, MO, USA) si examinate utilizand imersiunea de ulei si un microscop usor echipat cu 100* obiective (Nikon, Tokyo, Japan). Numarul celulelor apoptozice in 200µl a fost adunat si multiplicat cu 5 pentru a obtine numarul total de celule non-aderente apoptozice in suspensia de celule (Z). Procentul celulelor apoptozice = Z/numarul total de celule [100,000]*100.

Celulele aderente: Eprubetele de sticla acoperite continanad celule aderente au fost indepartate cu grija, in mediu uscat, fixate pe suporturi (lame) si tratate ca schite pentru celulele non-aderente. Datele colectate au fost analizate pentru atasamentul procentual, fagocitoza si apoptoza.

Evaluarea atasamentului si incercarea fagocitara. Celulele aderente unistratificate MCF-7 si MCF-10A cultivate cu fermenti in prezenta sau absenta MGN-3 au fost folosite pentru examinarea procentului din atasament. Evaluarea atsamentului de fermenti pentru celulele tumorale a fost calculat ca procentaj a 200 de celule tumorale care au fost atasate unuia sau mai multor fermenti. Cu respectarea fagocitozei o incercare anterioara a fost angajata cu mici modificari. Pe scurt, celulele aderente unistratificate MCF-7 si MCF-10A cultivate cu fermenti in prezenta sau absenta MGN-3 au fost folosite pentru examinarea procentului de fagocitoza ca in (B). Similar, evaluarea ridicarii fermentilor de catre celulele tumorale a fost calculata ca procentaj a 200 de celule tumorale care au ingerat una sau mai multe celule fermentate.

Experimente care confirma fagocitoza. Trei experimente diferite au fost duse la capat pentru a determina daca observatiile au reflectat actuala fagocitoza a fermentilor asupra celuleor MCF-7 sau simpla aderenta a fermentilor asupra celulelor canceroase. Experimentele sunt dupa cum urmeaza:

Microscopie fluorescenta: Fagocitoza examinata au fost inscriptionate cu propidium iodide (PI). Fermentii fluorescenti au fost adaugati celulelor unistratificate MCF-7 in 8 rezervoare intr-o proportie de 10:1. Dupa 2 ore, numarul celulelor aderente canceroase care au atasat/fagocitat fermentii fluorescenti a fost adunat utilizand un microscop fluorescent echipat cu 100*obiective (Nikon).

Efectul temperaturii scazute: Un set de experimente a fost realizat pentru a examina efectul racirii activitatii fagocitozice a celulelor MCF-7. In acest scop, celulele unistratificate MCF-7 au fost cultivate cu fermenti intr-o proportie de 1:10 la 4ºC pentru 2 ore. Procentul din atasament si fagocitozele au fost dupa aceea examinate de preparatele cu cytospin. Rezultatele au fost comparate cu celulele cultivate cu fermenti la 37º C.

Tratamentul cu cytochalasin B: Celule unistratificate MCF-7 (2*10 la puterea 5 celule/ml) au fost incubate cu cytochalasin B, (10 µg/ml) pentru o ora la 37ºC. Celulele au fost spalate de doua ori cu fosfat cu solutie tampon salina si incubate cu fermenti la o celula MCF-7 la o proportie a fermentilor de 1:10. Dupa doua ore procentul din atasament si fagocitoza au fost determinate de preparatele de citospin.

Evaluarea celulei tumorale supravietuitoare si apoptozele. Celulele unistratificate au fost cultivate cu fermenti intr-o proportie de 1:10. Pentru determinarea efectelor tratamentelor cu fermenti si MGN-3 asupra celulei supravietuitoare, celulele apoptozice aderente si nonaderente au fost identificate la intervale diferite si celulele apotozice au fost evaluate prin 4 metode diferite:
Colorarea cu Annexin V: Celulele MCF-7 au fost incubate cu sau fara fermenti (proportie 1:10) la 37ºC pentru 2 ore. Celulele care s-au detasat din unistratificare au fost colectate, spalate cu fosfat cu solutie tampon salina si suspendate in 100µl de solutie tampon de fixare Annexin V (Laboatoarele CalTag, Burlingame, CA, USA); 5µl de Annexin V marcat cu izotopi FITC a fost apoi adaugat suspensiei de celule si incubat la temperature camerei in intuneric. Dupa 15 minute de incubare, a fost adaugata 400 µl de solutie tampon de fixare cu Annexin V si fixatorul Annexin a fost analizat prin fluxul citometric. Zece mii de celule au fost achizitionate si analizate prin utilizand software-ul de Urmarire a Celulelor.

Analiza fluxului citometric. Analiza fuxului citometric a fost utilizata pentru examinarea procentajului de celule moarte non-aderente MCF-7. Celulele canceroase au fost cultivate cu celule cu fermenti intro proprtie de 1:10 in prezenta sau absenta MGN-3 (100µl). Celulele canceroase non-aderente au fost colectate dupa 4 ore iar procentajul celulelor moarte a fost examinat cu tehnica iodurii de propidiu utilizand fluxul citometric. Pe scurt, celulele non-aderente au fost fixate in methanol 70%, resuspendate in solutie tampon extrasa din ADN, spalata in fosfat cu solutie tampon salina si analizata cu Scannerul FAC ( Becton Dickinson, San Jose, Ca., USA).

Colorantul Giemsa. Apoptozele sunt morfologic definite de largirea celulelor, membrana cu bule si condensarea cromatinei. Aceste criterii au fost folosite pentru a identifica celulele apoptozice aderente MCF-7 si MCF10A in preparatele de cytospin colorate cu Gisema pe lame preparate. procentul celulelor apoptozice aderente au fost calculate prin observarea a zece zone diferite de pe lamele microscopului, fiecare continand 100 de celule. Procentul celulelor apoptozice non-aderente au fost de asemenea calculate utilizand preparatele de cytospin colorate cu Gisema preparata anterior.

Colorantul albastru trypan. Celulele apoptozice non-aderente MCF-7 au fost tratate cu colorant albastru trypan si numarate cu ajutorul unui microscop optic si a hemocitometrului. Procentul celulelor moarte =% celule moarte in mediu conditionat /numarul total [100,000] *100.

Analizele statistice. Intre a compara sensul tratamentului1 (fermenti) si tratamentului 2 (combinatie intre fermenti si MGN-3) au fost folosite analizele schimbarii de intentie.

Fig.1Efectul MGN-3 asupra atasamentului celulelor unistratificate MCF-7 la fermenti. Celule tumorale au fost cultivate cu fermenti intr-o proportie de 1:10 in prezenta (?) sau absenta MGN-3 (?). La 1,2 si 4 ore dupa cultivarea cu fermenti, celulele aderente de pe lamele au fost indepartate, colorate cu Giemsa si a fost calculat procentajul (%) din atasament (A). Datele reprezinta media ± SE a 5 experimente separate. Rezultatele au fost comparate cu celulele MCF-10A pentru control (?).*p<0.03, **p<0.02 comparativ cu celulele MCF-10A (B). Giemsa a colorat preparatul citocentrifugat aratand atasarea fermentilor la multiple celule MCF-7 la 1 ora dupa cultivarea celulelor canceroase cu fermenti. De notat fermentii, colorati albastru inchis, atasati la extensia lunga a celulelor MCF-7. Giemsa*400

 

Fig.2Actiunea MGN-3 asupra procentului fagocitozei fermentilor asupra MCF-7. Celulele tumorale au fost incubate cu fermenti intr-o proportie de 1:10 in prezenta sau absenta MGN-3. La 1,2 si 4 ore dupa cultivarea celulelor canceroase cu fermenti, celulele aderente de pe lamele au fost indepartate, colorate cu Giemsa si a fost calculat procentajul (%) fagocitozei (A). Datele reprezinta media ± SE a 5 experimente diferite. Rezultatele au fost comparate cu celulele MCF-10A pentru control.*p<0.03, **p<0.05 comparat cu celulele MCF-10A. Preparatele citocentrifugate arata celulele MCF-7 fagocitand fermenti, colorate albastru inchis, la 2 si 4 ore dupa cultivarea cu fermenti. de notat prezenta multiplelor vacuole ale fermentilor digerati inauntrul celulelor apoptozoice la 4 ore. Giemsa *400

Fig.3Procentajul din atasament si fagocitoza fermentilor fluorescenti asupra celulelor unistratificate MCF-7. Celulele MCF-7 au fost cultivate cu fermenti fluorescenti iar procentajul (%) din atasament (A) si fagocitoza (B) au fost calculate dupa 2 ore dupa cultivarea celulelor canceroase cu fermenti. Datele reprezinta media ± SE a 3 experimente diferite. *p<0.01 comparativ cu aceleasi celule la 1h

Fig.4Efectul racirii asupra unui procent din atasament si fagocitoza asupra celulelor unistratificate MCF-7. Celulele canceroase au fost cultivate cu fermenti intr-o proportie de 1:1 si tinute la 4°C si 37°C pentru 2 ore. Procentul din atasament (A) sau fagocitoza (B) fermentilor celulelor aderente MCF-7 a fost determinat in preparat cytospin. Datele reprezinta media ± SE a 3 experimente diferite. *p<0.01 comparativ cu celulele la 37°C.

Fig.5Efectul racirii asupra unui procent din atasament si fagocitoza asupra celulelor unistratificate MCF-7. Celulele canceroase au fost cultivate cu fermenti intr-o proportie de 1:1 si tinute la 4°C si 37°C pentru 2 ore. Procentul din atasament (A) sau fagocitoza (B) fermentilor celulelor aderente MCF-7 a fost determinat in preparat cytospin. Datele reprezinta media ± SE a 3 experimente diferite. *p<0.01 comparativ cu celulele la 37°C.

Rezultate

Studiile asupra fagocitozelor. Procentajele atasamentului si fagocitozei: Celulele unistratificate MCF-7 au fost cultivate cu fermenti in prezenta sau absenta MGN-3 si procentajele atasamentului si fagocitozei fermentilor de catre celulele MCF-7 au fost examinate la 1,2 si 4 ore. Datele din arata ca atasamentul celulelor MCF-7 la fermenti a survenit la un anumit timp, 13,4% la 1 ora si 25% la patru ore. Tratamentul cu MGN-3 a crescut nivelul atasamentului in toate momentele. Ilustratia din Figura 1B arata fermentii atasati la celulele MCF-7 la 1 ora. De asemenea, fagocitoza fermentilor de catre celulele MCF-7 au crescut pe masura ce timpul trecea: 6,9% la 1 ora si 14,3% la 4 ore. (Figura 2A) MGN-3 a crescut magnitudinea celulelor fagocitate de la 2 la 3 pliuri la 1-4 ore. Ilustratia din Figura 2B arata un numar de celule MCF-7 inghitind mai multi fermenti la 2 ore. De notat prezenta multiplelor vacuole de fermenti digerati inauntrul celulelor apoptozice la 4 ore (Figura 2C). Pe de alta parte, datele arata ca MCF-10A intr-un singur plan virtual nici nu ataseaza (3%) si nici nu fagociteaza (1%) fermentii (Figura 1A,B).
Verificarea experimentelor fagocitare. Pentru a face diferentierea intre tinetele fagotice atasate suprafetei celulei si acelea care au fost in acest momet fagocitate, au fost realizate trei experimente diferite. Fagocitoza a fost examinata utilizand fermenti fluorescnti. Numarul celulelor canceroase aderente atasate/fagocitate la fermentii fluorescenti au fost examinate. Dupa 2 ore, celulele aderente MCF-7 au aratat ca 15% atasament la fermenti (Figura 3A) si 11% activitate fagocitara (Figura 3B). Celulele unistratificate MCF-7 cultivate cu fermenti si tinute la temperatura scazuta (4ºC) au demonstrat un semnificant nivel scazut al fagocitozei (Figura 4B). Similar rezultatele au fost obtinute in urma tratamentului celulelor MCF-7 cu cytochalasin B, cunoscut ca un inhibitor al fagocitozei (33,34) (Figura 5).

Studii asupra apoptozei . Pentru a determina efectele tratamentelor cu fermenti MGN-3 asupra celulelor supravietuitoare, celulele apoptozice aderente si non-aderente MCF-7 au fost identificate la intervale diferite iar apoptoza celulelor canceroase a fost evaluata prin 4 metode.

Colorarea cu Annexin V: S-a cercetat daca fermentii induc apoptoza in celulele unistratificate MCF-7. Pentru acest scop, celule canceroase au fost cultivate cu fermenti intr-o proportie de 1:10 pentru 2 ore iar celulele apoptozice non-aderente MCF-7 au fost masurate prin colorarea cu Annexin V. Datele din Figura 6 arata ca din cultivarea celulelor MCF-7 cu fermenti a rezultat o crestere nesemnificativa a numarului celuleor apoptozice (36.1% comparative cu 6 .4% celule controlate netratate).
Analizele fluxului citometric : Supravietuirea celulelor MCF-7 la patru ore dupa tratamentul cu fermenti, MGN-3, sau fermenti+MGN-3 a fost examinata prin fluxul citometric. Rezultatele descrise in Figura 7 indica o crestere semnificativa a apoptozei celulelor non-aderente MCF-7 in timpul tratamentului cu MGN-3 (58% celule moarte fata de cele controlate 9.5%). Fermentii singuri de asemenea au cauzat o crestre substantiala in celule moarte (85%) comparat cu fondul. Tratamentul cu fermenti in prezenta MGN-3 a cerscut mai mult apoptoza celulelor tumorale (92%).
Colorarea cu Giemsa : Apoptozele sunt morfologic definite de largirea celulelor, membrana cu bule si condensarea cromatinei. Aceste criterii au fost utilizate pentru a identifica celulele apoptozice MCF-7 si MCF-10A in preparatul cytospin colorat cu Giemsa. Apoptoza survenita dupa cultivarea fermentilor cu celule MCF-7 a fost detectata in celulele aderente. Datele din Figura 8A arata ca 5.6% din celulele aderente MCF-7 sufera apoptoza la 1 ora dupa ce au fost cultivate cu fermenti ceea ce a dus la cresterea cu 10.7% la 4 ore.

Fig.6Colorarea cu Annexin V. Celulele MCF-7 au fost incubate cu sau fara fermenti (proportie 1:10) la 37°C pentru 2 ore. Celulele canceroase care au fost detasate din unistratificare au fost colectate iar proventajul celulelor apoptozice a fost masurat prin colorare cu Annexin V si flux cytometric. 10.000 de celule au fost achizitionate si analizate utilizand software-ul de urmarire a celulelor.

Fig.7Procentul celulelor moarte non-aderente MCF-7 a fost determinat prin fluxul cytometric. Celulele MCF-7 au fost cultivate cu fermenti intr-o proportie de 1:10 in prezenta sau absenta MGN-3 (100µg/ml) pentru 4 ore, iar celulele supravietuitoare non-aderente au fost determinate de fluxul cytometric utilizand tehnica iodurii de propidiu. Numarul din histograme reprezinta procentul celulelor moarte.

Tratamentul cu MGN-3 a crescut procentajul celulelor apoptozice La 1-4 ore. Apoptoza a fost de asemenea examinata la celulele non-aderente (Figura 8B). Preparatul de cytospina a aratat cresterea nivelului apoptozei peste timp. Adaugarea de MGN-3 a cauzat cresterea a doua pliuri in procentajul celulelor apotozice la toate intervalurile. Cand datele celulelor apoptozice aderente sunt combinate cu cele ale celulelor non-aderente, nivele semnificative ale apoptozei sunt detectate in Figura 8C: 11.5% la 1 ora si 21.7% la 4 ore. MGN-3 a crescut magnitudinea apoptozei de 207% si 134% la 1 ora si respective 4 ore. In contrast, datele arata de asemenea doar cu 0,2% celule apoptozice non-aderente MCF-10A dupa cultivarea cu fermenti.
Transformarile morfologice ale fermentilor care au indusa apoptoza celulelor canceroase sunt illustrate in Figura 9A – I. Celulele apoptozice carora le-a fost indus un numar mai mic sau mai mare de fermenti au fost notate la diverse intervale dupa cultivarea celulelor camceroase cu fermenti. Ceulele apoptozice MCF-7 cu condensarea cromatinei la 4 ore au fost notate in celulele aderente si non-aderente. Preparatele de asemenea celulele apoptozice cu fragmentarea AND-ului. Aceasta a fost urmata de membranele cu bule si fragmente nucleare situate inauntrul bulelor. De notat, celulele canceroase contin vacuole multiple cu fermenti ingerati si digerati. In final, nucleul dispare si celulele dobandesc culoarea colorantului trypan albastru.

Colorarea cu trypan albastru : Celule non-aderente MCF-7 au fost tratate cu colorant trypan albastru si numarate utilizand un hemocitometru. Poate fi vazut in Figura 10 ca fermentii au determinat apoptoza celulelor MCF-7, care a crescut cu timpul si a atins maximul la 4 ore (17%). Tratamentul cu MGN-3 a crescut efectul apoptozic al fermentilor si a aratat o crestere de 182% in procentajul celulelor apoptozice la 4 ore. Pe de alta parte, doar 0,2% celule apoptozice non-aderente MCF-10A au fost vazute la 1-4 ore dupa cultivarea cu fermenti.


Fig.8(A) – Actiunea MGN-3 asupra fermentilor care au indus apoptoza celulelor aderente MCF-7 utilizand colorantul Giemsa. Celulele tumorale au fost cultivate cu fermenti intr-o proportie de 1:10 in prezenta (ٱ) sau absenta MGN-3 (▲). La1,2 si 4 ore dupa cultivarea celulelor canceroase cu fermenti, celulele aderente de pe lamele au fost indepartate, colorate cu Giemsa, iar procentajul (%) celulelor apoptozice a fost calculat. Datele reprezinta media ± SE a 5 experimente diferite. Rezultatele au fost comparate cu celulele MCF-10A pentru control (♦). *p<0.02, **p<0.02 comparativ cu celulele MCF-10A. (B) Apoptoza indusa de fermenti a celulelor non-aderente MCF-7. Celulele unistatificate MCF-7 au fost cultivate cu fermenti in prezenta (ٱ) sau absenta MGN-3 (▲) pentru 1-4 ore. Celulele care inoata la suprafata au fost colectate, preparatele cytocentrfugate au fost realizate, colorate cu Giemsa iar procentajul celulelor apoptozice a fost calculat. Datele reprezinta media ± SE a 5 experimente diferite. Rezultatele au fost comparate cu celulele MCF-10A pentru control (♦). *p,).02, **p<0.02 comparativ cu celulele MCF-10A. p<0.03 comparativ cu celulele MCF-7 tratate cu fermenti. (C) Apoptoza indusa de fermenti a celulelor totala apoptozice. Celulele MCF-7 au fost cultivate cu fermenti in prezenta (ٱ) sau absenta MGN-3 (▲) pentru 1-4 ore. Procentajul % celulelor = procentul celulelor apoptozice aderente in Fig.8A + procentul celulelor apoptozice non-aderente in Fig.8B. Rezultatele au fost comparate cu celulele MCF-10A pentru control (♦). *p<0.01, **p<0.03 comparativ cu celulele MCF-10A.

Fig.9 – Examinare morfologica a celulelor aderente si non-aderente MCF-7. Celulele unistratificate MCF-7 au crescut pelamele si au fost cultivate cu S.cerevisiae distruse la caldura intr-o proportie de 1:10. Celulele care inoata la suprafata au fost colectate, a fost realizat preparatul cytospin care a fost colorat cu Giemsa. Preparatul arata controlul celulelor aderente MCF-7 fara tratament (A), celulele apoptozice aderente MCF-7 (sageata) cu condensarea cromatinei la 4 ore dupa cultivarea cu fermenti si apoptoza insotita de largirea si dezbinarea arhitecturii a multe celule aderente MCF-7 la 4 ore dupa tratament (C). Prepararea celulelor non-aderente singure si multiple la doua ore dupa tratamentul cu fermenti, arata ca apoptoza este insotita de condensarea cromatinei. Preparat aratand celle non-aderente MCF-7 cu fragmentare nucleara (G) si dezintegrarea care urmeaza in multiple membrane care contin vezicule cu fragmente nucleare (H). In final, (I) arata celule moarte care au capatat culoarea trypanului albastru. Notati (A-F) prezenta fermentilor colorati albastru inchis si multiplele vacuole ale fermentilor ingerati si digerati inauntrul celulelor apoptozice in preparat. Figurile 9 A-C, E si F Giemsa*400, D, G si H*1000

Fig.10 – Apoptoza indusa de fermenti a celulelor unistratificate MCF-7 utilizand trypan albastru. Celulele MCF-7 au fost cultivate cu fermenti pentru 1-4 ore. Celulele care inoata la suprafata au fost colectate, amestecate cu 100µl trypan albastru iar procentajul celulelor moarte a fost examinat utilizand microscop luminos dotat cu 60* obiective. Procentul celulelor moarte = procentul celulelor moarte de la suprafata/numarul total de celule [100,000]*100. Datele reprezinta media ± SE a 3 experimente diferite. Rezultatele au fost comparate cu celulele MCF-10 pentru control (♦). *p<0.03, **p<0.02 comparativ cu celulele MCF-10A.

Discutii

Celulele neoplazice dezvolta strategii variate pentru a scapa de sub supravegherea imunitatii si a gentilor chimiterapeutici. Prezentul studiu a fost facut pentru a examina efectele apoptozice ale S.cerevisiae asupra celulelor cancerului de san, care mai repede modeleaza cresterea celulelor canceroase. Datele au aratat ca celulele unistratificate MCF-7 fagociteaza S.cerevisiae. Rezultatele confirmate de microscopul fluorescent, tratamentul cu cytocalasin B si scaderea temperaturii au exclus posibilitatea ca aderenta non-specifica se calculeaza pentru aceasta observatie. Rezultatele au demonstrat de asemenea ca S.cerevisiae este un inductor potent al apoptozei in celulele MCF-7 asa cum indica colorarea cu Annexin V si fluxul citometric. Analizele morfologice cu colorant Giemsa au dezvaluit prezenta multiplelor vacuole ale fermentilor ingerati si digerati inauntrul celulelor canceroase apoptozice .

Lipsa evidentelor in ceea ce priveste faptul ca daca efectele apoptozice ale fermentilor sunt selective pentru celulele canceroase ne indeamna sa examinam efectele S.cerevisiae asupra celulelor non-tumorale MCF-10A derivate din tesut uman mamar fibrochistic (35).

In contrast, celulele MCF-7 de la adenocarcinomul de san uman a fost aratat a fi tumorale in athymic nude mice(36-38). Aratam aici ca celulele unistratificate MCF-7 fagociteaza fermentii si sufera apoptoza, in timp ce virtual nu a fost observata in celulele MCF-10A nici fagocitoza si nici apoptoza indusa de fermenti. Procesele apoptozice variaza in concordanta cu natura maligna a celulelor, la fel celulele non-tumorale unistratificate apar ca fiind mai rezistente la apoptoza indusa de fermenti. Aceasta demonstreaza ca celulele normale nu sunt fagocitare iar in timpul transformarii in celule canceroase dobandesc ulterior abilitati fagocitare. O posibila explicatie este aceea ca celulele canceroase exprima suprafata receptorilor pentru atasament/fagocitoza care devin expusi in timpul cursului spre malignizare si care altfel sunt mascati in celule care nu sunt transformate.

Studiile trecute si prezente (28,29,39) au dezvaluit diferente izbitoare intre nivelele fagocitozei si apoptozei induse de fermenti a celulelor MCF-7 in suspensie, comparate cu cele intr-un singur plan (unistratificate). Celulele in suspensie preparate prin tripsinizare au demonstrat o mai mare magnitudine a fagocitozei si apoptozei comparate cu acelea intr-un singur plan (unistratificate). Tripsina stimuleaza integrina α5β1 – aderenta dependenta de celulele umane de cancer gastric (40). Receptorii integrinei celulelor mieloide mediaza fagocitoza diversilor liganzi incluzand trombocite (cooled platelets) si agenti patogeni non-opsonizati (43). De vreme ce celulele MCF-7 poarta receptorii integrinei (44,45), este posibil ca tripsina sa stimuleze receptorii integrinei celulelor MCF-7 care mediaza fagocitoza S.cerevisiae. Efectele apoptozice ale fermentilor sunt asociate celulelor tumorale dar mecanismul nu este clar. In timp ce aratam ca caspases (enzime implicate in distrugerea celulelor – de exp. daca o celula devine canceroasa, caspasele distrug celula inainte de raspandirea cancerului) pot fi implicate in apoptoza indusa de fermenti a celulelor adenocarcinomului de colon (30), apoptoza celulelor cancerului de san pare a fi mediata printr-un mechanism independent al caspaselor (39).

MGN-3 este un arabinoxylan extras din tarate de orez (46) dovedit a fi un potent
Raspun modificator biologic si are abilitatea de a ridica functia imunologica a celulelor NK (47,48), T si B si a celulelor macrophage (49). Adaugat activitatii imuno-modulatorii, am aratat ca MGN-3 poate contribui la expunerea receptorilor implicati in fagocitoza/ atasament. MGN-3 face ca celulele umane leucemice HUT sa fie receptive la apoptoza indusa de CD95 prin descresterea Bcl2 (0). Este posibil ca MGN-3 sa cationeze printr-un mechanism similar cu celulele MCF-7. Studiile viitoare trebuie sa lamureasca mecanismul exact care sa sublinieze efectul MGN-3 asupra cresterii apoptozei induse de fermenti.
Acest studiu a confirmat observatiile anterioare ca celulele canceroase ale sanului uman, limba si colon sufera apoptoza urmata de fagocitoza a S.cerevisiae in vitro distruse la caldura. Nu avem cunostinta de nici o proba clinica asupra eficacitatii fermentilor asupra cancerului; in orice caz, testele in care s-au utilizat fermenti selenizati ca un agent chimio-preventiv au fost conduse in multiple probe clinice asupra cancerului (51-53), probe in care a fost examinat efectul suplimentelor cu seleniu asupra cancerului. Identificarea componentelor active in fermentii care induc apoptoza pot prezenta o varianta terapeutica in dezvoltarea medicamentului pentru cancer. Specificitatea si siguranta MGN-3 si fermentilor distrusi la caldura ne da un avantaj asupra agentilor anticancer disponibili in mod current si pot stabili fundamental pentru studiile in vivo cu implicatii terapeutice importante.
 
  comenteaza articolul   Imprima articola
 
 
 
 
Cosul dvs.(0)
Comenzi telefonice
021 332 7102
021 332 7164
 
 
Iveron Soft